高灵敏化学发光检测试剂盒（ECL）使用方法

高灵敏化学发光检测试剂盒（ECL）

ECL Reagent是一种基于Luminol的高灵敏性、非放射性化学发光底物，用于检测免疫印迹中固定在膜上的标记有辣根过氧化物酶（HRP）的蛋白，可检测pg级的抗原。Luminol在酶的催化作用下发生氧化降解，在增强剂的作用下发射波长为428nm的极-强的光信号，持续时间长、稳定性高、检测方便。

其原理是，蛋白质或核酸电泳分离后转印到膜上，以一抗及HRP标记的二抗结合膜上的目的蛋白，或以HRP标记的探针直接或间接结合膜上的核酸。洗膜后用本产品配制的ECL工作液，在室温下孵育膜1分钟，将印记膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒中，然后暗室中将X光胶片压在膜上曝光数秒至数分钟。显影定影后蛋白质或核酸条带可清晰显示在X光胶片上。也可不进行X光胶片曝光，而直接对印记膜进行荧光CCD扫描。光信号支持重复曝光，也可洗膜脱抗体后供再次检测。

使用方法

1. 按常规方法完成SDS-PAGE和电转膜操作，将转印好的膜从转膜装置上卸下来，并用封闭剂封闭膜上的非特异结合位点，室温下摇晃封闭1小时或2-8℃静置封闭过夜。

  ※注意：封闭非常重要。

2. 弃封闭液，加入一抗工作液，室温下摇晃孵育1小时或2-8℃静置孵育过夜。（抗体孵育浓度：一抗100～500ng／mL，二抗10～50ng／mL）。

3. 用洗膜缓冲液漂洗膜2次，然后用充分体积的洗膜缓冲液洗膜3-6次，每次5分钟。

4. 用标记HRP的二抗工作液室温下孵育1小时。

5. 重复步骤3，*洗掉没有结合的二抗。

6. 将试剂A和试剂B按1:1的比例混合成ECL工作液，根据每平方厘米膜使用0.1-0.2mL的量配制工作液，用ECL工作液充分覆盖膜后室温孵育1分钟。

  ※注意：ECL工作液需现配现用，室温下放置不能超过1小时。

7. 用平头镊钳住膜，垂直置于吸水纸上吸去过量试剂，将膜置于两层保鲜膜之间，小心赶走膜与保鲜膜之间的气泡。

8.  将膜吸附蛋白的面朝上置于暗盒中，于暗室中，取出胶片覆于膜表面，第一次曝光60秒，之后根据结果调整曝光时间。

  ※注意：确保膜和保鲜膜上多余的液体已移除，曝光过程中要保持胶片干燥。

9. 取出胶片在显影液和定影液中显影。如果信号太强，减少曝光时间或脱掉抗体后降低抗体浓度重新孵育。

10. 在孵育后的初5-30分钟内发光*，发光长可持续数小时，但随着时间的推移光信号减弱。

  ※注意：膜与胶片之间的移动，将影响图片效果，造成干扰。