血液总RNA提取试剂程序

血液总RNA提取试剂程序

描述：血液总RNA提取试剂特别加强了对液体标本如全血等RNA的提取能力。直接将液体标本与血液总RNA提取试剂混合即可，极大简化了样品的提取前处理过程。并且其提取能力强大，甚至可以从已经凝固的血液块中提取出高纯度的RNA。使用方法与RNAtrip 和TRIzol相似，可在30－60分钟内完成。获得的高纯度总RNA可用于RT-PCR、Northern Blot、RNA酶保护、Poly(A) mRNA纯化、体外翻译等实验。 

储存：4oC密封避光保存一年以上有效。
适用：液体标本(200µl/ml): 全血、体液、尿液，悬浮细胞、病毒微生物样品等。

RNA提取程序
液体标本：全血、体液、尿液，悬浮细胞、病毒微生物样品等。每200ml液体样品加1 ml RNAtrip LS，置冰上。未抗凝的凝固血液按固体组织处理。
1. 将裂解物转移到1.5 ml离心管，置冰上10分钟。如需暂停操作，裂解物可冻存于－70 oC至少一个月。
2. 加入0.2体积的氯仿(0.2ml)，充分颠倒混匀，冰上孵育1－5 分钟，溶液开始分相。有时分相不明显，不影响提取。
离心12,000g 4 oC 10 分钟，溶液分为两相。RNA保留于上层无色透明水相约0.6ml，下层为有机相，两相界面是一层薄膜其厚度与组织细胞类型和多少有关。小心吸出上层水相转移到新离心管，但应留0.5－1 mm厚水相，以免扰动和吸入下面的碎片和无机相。如吸入无机相和碎片，应将所取水相放回管中并重新离心10分钟，再吸取水相。这一点至关重要，违背此原则容易导致RNA降解和DNA污染。
3. 加入等体积异丙醇(0.5ml)于含有上清的新离心管中，充分混匀。冰上孵育10 分钟绰绰有余。但－20 oC 放置一至数小时，可回收几乎所有的RNA。如需尽可能多的RNA，或起始组织细胞的量很少，或用户需要暂停操作时，可以这样做。用更低的温度和更长的时间进行沉淀并不必要。
4. 离心, 12,000g，4 oC，10分钟。小心弃上清，管底可见少许黄白色RNA沉淀。如初始组织细胞量少，RNA沉淀用肉眼几乎难辨，但不影响实验。
5. 洗涤沉淀。立即加入1 ml 75%乙醇，颠倒混匀数次，12,000g 5分钟。弃上清，尽量吸去管壁上的液体。乙醇洗涤后RNA沉淀容易漂浮，勿倒掉RNA沉淀。此时可将RNA沉淀保存在75%乙醇中，4 oC一周或－20 oC一年。
6. 敞开管口空气干燥5-10分钟，RNA沉淀干燥至胶冻状即可。过分干燥将使RNA难以溶解。用50-100 ml DEPC处理的高压消毒纯水或TE溶解沉淀。如RNA难溶，可55 oC加热10分钟，或反复冻融数次助溶。RNA溶液可保存于－70 oC或液氮中；或加3倍体积乙醇－20 oC冻存，用时离心沉淀。
7. 测定OD值。计算RNA浓度和OD260/280比值。RNAtrip LS提取的RNA绝少蛋白污染，比值通常在1.6－2.0之间均属正常。OD260/280比值受很多因素影响。起始组织量过大或RNAtrip LS试剂过少，或吸取了有机相或碎片，将使OD260/280比值降低，应预以避免；RNA用水溶解或pH偏酸OD260/280偏低，而用TE或离子强度较高的溶液溶解时该比值较高，但均不影响RNA使用。用户应该知道，即便是已降解的RNA，该比值也能达到看似完-美的2.0左右，因此该比值并非判断RNA降解与否的指标。可进行RNA琼脂糖电泳检查RNA完整性(见说明2)。