PCR技术服务中PCR的特异性效率和忠实性

　　PCR的特异性、效率和忠实性是体现一个PCR实验的质量的三个重要指标。特异指一个PCR反应只产生一个扩增产物，即预期的靶序列。效率指每个循环里扩增的实际产物的量与理论上应该达到的量的接近程度。忠实是指在PCR反应过程中，由DNA聚合酶诱导的错配是可以忽略不计的。

　　这三个参数中的每一个都受到PCR反应中众多成分的影响，包括缓冲体系、酶、模板甚至PCR循环程序，但遗憾的是，高特异性的反应条件与高产量的反应条件并不一致，同时高保真也往往导致低产率。因此在设计PCR实验时，要根据实验目的，有针对性地对这三个参数有侧重地优化。如在片段长度多态性分析时，PCR产物的产量和特异性就比忠实性重要;而若是研究个别DNA分子或稀有突变，忠实性的重要性不言而喻。

　　特异性是PCR的基础，它首先取决于引物设计与模板的互补。一套理想的引物能有效地与靶序列杂交，而与模板中出现的其它序列的杂交可以忽略不计。一般引物与模板中非靶序列发生4个或更少连续碱基互补都不会在电泳时体现出来。

　　PCR反应的效率影响特异性产物的积累，根据Chien等人给出的靶序列的累积与循环数的函数关系，扩增效率高的时期为29个循环之前的指数增，之后每次循环的效率就开始大大降低，产物停止指数积累，此时理论上靶序列的拷贝数已达到1012，而1012拷贝的特定序列对于绝大多数分子生物学实验已满足要求，且PCR的许多应用尤其是定量实验都要求扩增在指数生完成，因此，一般PCR反应都在29个循环之前取出，没有必要再增加循环数。

　　PCR反应的忠实性主要与酶有关，虽然可以通过改变反应缓冲液的条件大大提高忠实性，但是也远比不上更换高保真的聚合酶的效果。聚合酶的高保真能力体现在其拥有3’→5’的外切酶校正活性。需要指出的是，不论是否使用高保真的聚合酶，PCR的过程都有可能有错误碱基渗入，因此在对忠实性有要求的实验中，经PCR得到的序列必须测序验证。