加强型RIPA裂解液实验技巧
描述: 加强型RIPA裂解液加强型对动物细胞胞膜、胞浆、胞核成分有较强裂解作用,是常用的细胞组织快速裂解液。使用加强型RIPA 裂解液特别适于提取膜蛋白以及western blot和大多数蛋白-蛋白相互作用的实验等。
储存:
4 ℃保存 12个月有效
规格:
100ml 500ml
制备细胞裂解产物
1. 800g4℃离心5分钟收集培养细胞,估计细胞离心后的体积(PCV,106cells=~20ul,107cells =~100ulPCV);
2. 每50-100ulPCV加入5倍体积RIPA裂解缓冲液(250-500ul),冰浴中放置10分钟,并每隔5分钟在漩涡混合仪上振荡30秒;
3. 12000g4℃离心10分钟,将上清转移到新的离心管中,即得细胞总蛋白产物;
4. 假如所得蛋白产物较为粘稠,95℃加热5分钟,然后迅速冰浴5分钟,12000g4℃离心10分钟,将上清转移到新的离心管中,即得细胞总蛋白产物。
制备组织裂解产物
1. 取50-100mg组织在冰上剪成碎片,用预冷的PBS洗涤2次离心弃去PBS;
2. 加入0.5-1ml预冷RIPA裂解缓冲液;
3. 4℃用玻璃匀浆器匀浆20-40次,直到95%的细胞被破碎,然后在冰浴中放置10分钟,并每隔5分钟在漩涡混合仪上振荡30秒;
4. 12000g4℃离心10分钟,将上清转移到新的离心管中,即得组织总蛋白产物;
5. 假如所得蛋白产物较为粘稠,95℃加热5分钟,然后迅速冰浴5分钟,12000g4℃离心10分钟,将上清转移到新的离心管中,即得组织总蛋白产物;
6. 20%的甘油保存于-70oC或-20oC。
注意:
1. 在转移上清液时不要吸入底部的沉淀物;
2. 在做免疫沉淀或免疫共沉淀时最好在实验前进行蛋白的提取,以避免某些不稳定蛋白的降解;
3. 在该RIPA裂解缓冲液中未加入蛋白酶抑制剂。