明胶酶谱法MMP2/MMP9检测试剂盒注意事项

明胶酶谱法MMP2/MMP9检测试剂盒注意事项

本试剂盒采用酶谱法(Zymography)检测MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一种广为使用的、基于 SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM，高于ELISA方法，其基本原理1 和程序是：制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE 凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳结束后 取出凝胶与酶反应Buffer 孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景， 但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能 同时指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学 反应缓冲液，可检测少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶谱及活性，检测灵敏度~1nM。试剂 盒可进行50次标准小胶检测，如果小胶加样孔为10~15个，则总计可检测500~750个样品。

注意事项：

1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。

2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6、细胞样本用PBS 5倍体积震荡裂解,估算细胞的体积，然后加入5倍体积的PBS，涡旋振荡15-30s,而后静置或低速离心.或者手动震荡。

7、组织或者细胞的话可以用PBS，可以用低渗溶液如三分之一或者四分之一的生理盐水按照5倍体积加入后震荡裂解细胞，离心即可，步骤和提蛋白很相似即可,其实重点的步骤主要是采用低渗裂解液进行裂解，组织的话可以匀浆20-30次，然后10000转左右离心，5分钟取上清即可

关于40左右出现的条带，确实是我们好多客户实验过程中都会出现的，像什么Hela细胞、肝癌细胞、巨噬细胞等。还是之前给您解释的，这个和细胞类型及明胶酶家族种类是有关系的；另外由于明胶酶谱的蛋白样品是不*变性的，因为并没有煮沸的过程，所以可能由于变性不充分的原因导致其分子量部位不同。我们也有好多客户做检测的时候会制备一个上样的浓度梯度，下面给您附一个近一个客户一次实验的结果。他的在40左右也是出了条带的。