组织甘油检测试剂盒样本处理方法

组织甘油检测试剂盒样本处理方法

甘油是 甘油三酯 的 水解 产物。 与游离脂肪酸一样，甘油含量是甘油三酯水解 反应 的可靠检测指标 ，但检测更加方便 。 本 试剂盒采用优化 步骤，能够检测实体组织、细胞中的甘油含量，线性范围为10---1200 μ mol/L 。

原理：

在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化为 3-磷酸甘油， 再被甘油磷酸氧化酶氧化 产生过氧化氢；在过氧化物酶作用下生色底物转化为苯醌亚胺，其光密 度值与甘油浓度成正比。

适用范围：

测定 实体 组织 、 细胞中的甘油浓度。

一 组织细胞裂解

细胞（包括分化的脂肪细胞） 裂解：

消化、离心收集细胞。或直接在培养皿内裂解。通常 6 孔板单孔约 2x10 6 个细胞， 75cm 2 瓶约 1x10 7

细胞。按比例每 1~2 x 10 6 细胞 加 0 .1ml 裂解液震荡或涡旋裂解后 ，静置 10 分钟。

动物组织裂解：

切记要预先将新鲜组织剪切称重后再进行保存。组织冻存后再进行解冻、剪切、称重可能会产生严重的测量误差。离心管精确称重，加入组织块后再称重，二者相减即减量称重法 计算组织重量 约 100mg) 。强烈建议按比例每 1mg 组织加10μl 裂解液以减少样品间蛋白和脂质含量变异而产生的误差。（ 注意：裂解液用量在 1ml 或更多可保证有效的裂解与脂取）。用电动高速匀浆器或手动玻璃匀浆器破碎组织。（不超声方法，因其不能*和均匀破碎。应根据预实验调整初始的组织细胞加入量），而后，静置 10 分钟。

二  裂解液处理：

1. 取适量上清液转移到 1.5ml 离心管中 进行步骤 2 的操作。余下的裂解液可用BCA 法蛋白定量试剂盒 P1511 进行蛋白定量或-20℃ 储存。

2. 70℃ 加热 10 分钟灭活脂肪酶，可能出现絮状沉淀。

3. 室温 5000 rpm 离心 5 分钟 ，上层 清液 即可用于酶学测定。

三 工作溶液 配制：

按 4 :1 比例 取 4 ml 试剂 R1 与1 ml 试剂 R2 混合 即可， 立即使用或 4℃ 保存<1 天，变色弃去 。 （注意：谨防来源不明但容易发生的甘油污染，可来自操作者本人或标准品液体微粒溅射等。）

四 标准 品稀释

用蒸馏水 生理盐水或与样品缓冲液一致的液体 ，将 4 mM 甘油标准品倍比稀释为1000 、 500 、 250 、 125 、 62.5 、 31.25、 15.625 、 7.8125μ mol/L 通常取其中 4~6 管即可，注意设置 0 浓度对照反应管 。

五甘油测定

1. 参见下表加样 。待测样品体积 10 μl ，多加可能会抑制反应。

2. 37℃或 25℃反应 10 分钟。 反应平衡后颜色在60 分钟 内稳定。

3. 先用蒸馏水 工作液的空白管调零，然后 测定各管OD 值 。

4. 绘制标准曲线并计算甘油浓度 。

附Excel 作图步骤 ：各标准管 OD 值为 y 轴，标准 品 浓度为 x 轴 。 ( 鼠标左键圈住数据，点击做图向导，选择 散点图 --，点击 完成 。 ( 鼠标右键点图上 的某 一点，点击 添加趋势线 --，点击 选项 --，点击 显示公 式 和 R 2 值 。

5. 以每 mg 蛋白浓度或细胞数校正甘油含量。