乙酸激酶（ACK）活性检测试剂盒操作原理

乙酸激酶（ACK）活性检测试剂盒操作原理

产品说明：
ACK广泛存在于生物体内，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其
是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。
测定原理如下：（1）ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，（4）在340nm下测定NADH氧化生成NAD+
速率，即可反映ACK活性。
注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者
增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
台式离心机、紫外分光光度计、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、细菌或细胞处理：
收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或
细胞（功率 20%，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测。
2、组织处理：
称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心 20 分钟，取上清，置冰上待测
3、血清（浆）：直接检测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂一于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）保温15min。

注意事项：
1、 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
2、 比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入
37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、 ΔA大于1时，建议稀释后测量，注意计算公式乘以稀释倍数；ΔA小于0.01时，建议延长反应时间测量，注意
计算公式变化