乙酸激酶(ACK)活性检测试剂盒操作原理
产品说明:
ACK广泛存在于生物体内,催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP,是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶,尤其
是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。
测定原理如下:(1)ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP,(2)丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸,(3)乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+,(4)在340nm下测定NADH氧化生成NAD+
速率,即可反映ACK活性。
注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者
增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
台式离心机、紫外分光光度计、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1、细菌或细胞处理:
收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液,超声波破碎细菌或
细胞(功率 20%,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),15000g,4℃,离心 20 分钟,取上清,置冰上待测。
2、组织处理:
称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;15000g,4℃,离心 20 分钟,取上清,置冰上待测
3、血清(浆):直接检测。
二、测定步骤
1、 紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。
2、 将试剂一于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)保温15min。
注意事项:
1、 测定过程中样本和所有试剂在冰上放置,以免变性和失活。
2、 比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入
37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、 ΔA大于1时,建议稀释后测量,注意计算公式乘以稀释倍数;ΔA小于0.01时,建议延长反应时间测量,注意
计算公式变化