活死细胞染色试剂盒是Calcein-AM和PI 的双重染料

活死细胞染色试剂盒是Calcein-AM和PI 的双重染料

产品说明：
Calcein-AM 是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，发绿色荧光（Ex=490nm, Em=515nm）。因其在传统的 Calcein（钙黄绿素）基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子 Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂（如 BCECF-AM 和 CFDA)相比，由于 Calcein, AM 细胞毒性极低，适合用于活细胞染色的荧光探针，而且不会抑制任何的细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。
 

由于死细胞缺乏酯酶，Calcein-AM 仅用于对活细胞的细胞生存能力测试和短期标记。因此，
Calcein-AM 常常与死细胞荧光探针如碘化丙啶（PI）等联合使用，同时进行活细胞和死细胞的荧光
双重染色。碘化丙啶（Propidium iodide，PI）不能穿过活细胞的细胞膜，仅能穿过死细胞膜的无序
区域而到达细胞核，并嵌入细胞的 DNA 双螺旋从而产生红色荧光（Ex=535 nm, Em=617 nm），因此
PI 仅对死细胞染色。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm 激发，因此可用荧光显微镜同时观察活
细胞和死细胞。而用 545 nm 激发，仅可观察到死细胞。
 

本试剂盒的工作原理就在于 Calcein-AM 和 PI 的双重染料，来进行活细胞和死细胞的双重染色
标记，从而进行活细胞和死细胞水平的分析。根据我司优化的实验体系，单次就 200µl 细胞悬液进
行染色，可以做 500 次检测。

染色步骤
2.1 对于贴壁细胞，先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA 消化细胞，之后离心收集细胞（1000 rpm，3min）。
对于悬浮细胞，直接离心（1000 rpm，3min）收集细胞。
2.2 去上清，用 1×Assay Buffer 充分清洗细胞 2~3 次，以充分去除残留的酯酶活性。
2.3 用 1×Assay Buffer 制备细胞悬液，使其密度为 1×105~1×106细胞/ml。
2.4 取 100µl 染色工作液加入 200µl 细胞悬液内，混匀，37℃孵育 15min。
注意：如果需要，可延长孵育时间至 30min。
2.5 荧光显微镜下使用 490±10 nm 激发滤片同时检测活细胞（黄绿色荧光）以及死细胞（红色荧光）。
另外，使用 545nm 的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行
检测。
注意：可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的工作浓度。
a) 用 0.1%皂素或者 0.1-0.5%孵育细胞 10min，或者用 70%乙醇孵育细胞 30min，从而制备死
细胞；
b) 用 0.1-10µM 的 PI 溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的
工作浓度。
c) 用 0.1-10µM 的 Calcein-AM 进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的工作浓度。然后用
此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。
注意事项：
1）由于 Calcein-AM 对湿度非常敏感，若是 Calcein-AM 溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖
子。建议根据单次用量，分装密封保存。Calcein-AM 工作液必须现配现用。
2）碘化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作时一定要注意防护。若接触到皮肤，需要立即用自来水清
洗。
3）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。