手把手教您如何完成质粒DNA提取实验

手把手教您如何完成质粒DNA提取实验

实验方法原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

实验材料：大肠杆菌
试剂、试剂盒：Tris-Hcl EDTA 葡萄糖 NaOH KAac NaAc 异丙醇 溶菌酶 酚:lv仿 无水乙醇 LB培养基
仪器、耗材：超净工作台 培养箱 摇床 恒温水浴锅 台式离心机 取液器 低温冰箱 冷冻真空干燥机 电泳仪 水平电泳槽 紫外观测仪
实验步骤：
一、材料与试剂准备
1. 材料：大肠杆菌。

2. 仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，冷冻真空干燥机，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪。

3. 试剂：

（1）Solution I ：25 mM Tris-Hcl（pH7.4），10 mM EDTA（pH8.0），50 mM葡萄糖，高压灭菌，4℃保存。

（2）Solution II ：0.2 M NaOH， 1%SDS 现配现用。

（3）Solution III ：5 N KAc pH4.8，高压灭菌，4℃保存。

（4）3 M NaAc pH5.2，高压灭菌，4℃保存。

（5）异丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/lv仿，无水乙醇，70%乙醇，LB培养基，电泳试剂。

二、操作步骤

1. 细菌繁殖：LB培养基，2 ml/20 ml，37℃，200 rpm，摇一摇，过夜。

2. 离心10 min，5 000 rpm， 4℃；弃上淸液。

3. 沉淀（菌体细胞）预冷的TES缓冲液洗涤，离心10 min，5 000 rpm， 4℃，加入预冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。

4. 重新悬浮，加入150 ul溶菌酶母液，室温放置5 min。

5. 加入1.2 ml Solution II， 冰浴5 min。

6. 加入0.9 ml预冷乙酸钾，混匀，离心10 min，12 000 rpm，4℃。

7. 加入1.5 ml异丙醇，-20℃冰箱内放置15 min。

8. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。

9. 取沉淀，悬于400 ul TE缓冲液中。

10. 加入40 ul，3 M NaAc。

11. 酚/lv仿，抽提，乙醇沉淀。

12. 离心10 min，12 000 rpm，4℃。

13. 取沉淀，冷冻干燥，再悬浮于50 ul TE缓冲液中。

14. 电泳检测提取DNA的质量。

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