抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的操作步骤

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的操作步骤

抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）是破骨细胞的标志性酶，特异性分布于破骨细胞中。TRAP染色试剂盒即是用于显示组织中的破骨细胞。其中基本原理在于，在含酒石酸的酸性条件下，抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP能将萘酚AS-BI磷酸盐水解，产生的萘酚AS-BI与六偶氮副品红结合，形成非水溶性的酒红色物质沉积在酶活性原位，从而实现对抗酒石酸酸性磷酸酶的显色和定位。本产品基本组成成分：反应缓冲液主要成分为醋酸缓冲液及酒石酸钾钠，pH约5.0；副品红溶液，含5%副品红；亚硝酸钠溶液主要成分为4%亚硝酸钠；AS-BI磷酸盐底物溶液，主要成分为20 mg/mL萘酚AS-BI磷酸盐。经本产品染色后，破骨细胞中的TRAP呈酒红色，定位于细胞浆。按照切片上每个组织点300 μL用量，本试剂盒可以做50次以上TRAP染色。

储存与运输：冰袋（wet ice）运输；2-8℃避光保存，其中AS-BI磷酸盐底物溶液-20℃保存，有效期12个月。

配制TRAP工作液：

（1）取50 μL副品红溶液（G1050-2）与50 μL亚硝酸钠溶液（G1050-3）在洁净离心管中混匀，得到六偶氮副品红溶液；

（2）向第1步的100 μL六偶氮副品红溶液中加入100 μL AS-BI磷酸盐底物溶液（G1050-4），吹吸数次充分；

（3）吸取1.8 mL反应缓冲液（G1050-1）加入到第2步的混合液中充分混匀；

（4）第3步的混合液经针式滤器过滤（0.45 μm水系滤膜）即得到TRAP工作液。

注意：务必按照所属顺序配制工作液。每个组织点大约需要200-300 μL工作液，根据使用量配制，现配现用，避免浪费。

石蜡切片操作步骤（供参考）

1. 石蜡切片脱蜡至水，纯水洗数分钟。

2. 将切片用组化笔化圈后放在（加有一定量的防止切片蒸干的纯水）湿盒中，用纯水37℃孵育2 h。

3. 切片孵育完成后倾去纯水，滴加过滤好的TRAP工作液覆盖组织，置于37℃避光反应20-30 min。

4. 复染细胞核：倾去孵育液并水洗，以苏木素染液进行染核。

5. 脱水，透明，以中性树胶封片。

细胞爬片操作步骤（供参考）

1. 细胞固定：吸除细胞培养液，加入4%多聚醛固定15-30 min，蒸馏水洗3次。

2. 细胞破膜：以0.2% Triton X-100溶液覆盖细胞进行破膜处理20-30 min，蒸馏水轻洗3遍。

3. 孵育染色：将TRAP工作液加到细胞孔板内覆盖细胞，37℃避光孵育20 min，蒸馏水洗3次。

4. 细胞核复染：吸除孵育液并水洗，以苏木素染液进行染核。

5. 加入适量无水乙醇脱水，取出孔板中的盖玻片，吹风机吹干，倒扣在洁净的载玻片上以中性树胶封片。

实验流程：脱蜡至水—染液配制-Trap染色-苏木素浅染核-脱水封片-显微镜镜检 　　

结果判读：破骨细胞呈酒红色或浅红色，细胞核呈浅蓝色

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）的操作步骤