原位杂交实验的实验流程表和样本处理注意事项

原位杂交实验的实验流程表和样本处理注意事项

九游AG信誉提供原位杂交实验检测服务。原位杂交实验通常流程由组织切片+探针+DAB染色+扫片或者拍照构成，那么详细的操作步骤和对样本的处理要求具体是什么呢，让我们一起来探索一下吧！

实验流程：

　　1、组织固定：组织取出洗净后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

　　2、脱水：组织固定完成后经梯度酒精脱水后浸蜡，包埋。

　　3、切片：石蜡经切片机切片，摊片机捞片，62°烤箱烤片2h。

　　4、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

　　5、消化：根据组织固定时间长短，切片于修复液中煮沸10-15分钟，自然冷却。后基因笔画圈，根据不同组织不同指标特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。纯水冲洗后PBS洗3次×5min。

　　6、阻断内源性过氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

　　7、预杂交：滴加预杂交液，37°C孵育1h。

　　8、杂交：倾去预杂交液，滴加含探针杂交液, 恒温箱 37度杂交过夜。

　　9、杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室温洗10min。若非特异杂交体较多，可以增加甲酰胺洗涤。

　　10、滴加封闭液：滴加封闭血清 BSA。室温30min。

　　11、滴加鼠抗高辛标记过氧化物酶(anti-DIG-HRP)：倾去封闭液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min，后PBS洗4次×5min。

　　12、DAB显色：切片稍甩干后，在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，纯水冲洗切片终止显色。

　　13、复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1%盐酸酒精分化数秒，自来水洗，氨水返蓝，流水冲洗。

　　14、脱水封片：将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，将切片从二甲苯中拿出稍晾干后，中性树胶封片。

　　15、显微镜检，图像采集分析。

　　结果判读：

　　阳性为棕黄色，细胞核为蓝色。

送样要求：

1、切片前处理要求：新鲜组织干冰运输后做冰冻切片；或取2mm左右厚度的新鲜组织，5min内投入原位杂交固定液内固定，4℃低温保存运输，切勿冷冻结冰，尽快包埋切片后进行原位杂交实验，固定时间过长影响核酸检出率；

2、冰冻切片：冰冻切片-20℃运输；

3、石蜡切片：石蜡切片常温运输；

4、细胞爬片：细胞爬片加原位杂交固定液固定15min后，换无酶PBS，密封，4℃运输。

原位杂交实验的实验流程表和样本处理注意事项